染色质免疫沉淀实验（Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChIP）详细步骤（仅供参考）

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白质与 DNA 相互作用的核心技术，通过甲醛交联固定细胞内 DNA - 蛋白质复合物，利用特异性抗体富集目标蛋白结合的染色质片段，经解交联、DNA 纯化后，通过 qPCR 或测序（ChIP-seq）检测目标蛋白结合的 DNA 序列，可精准分析转录因子结合位点、组蛋白修饰分布等表观遗传调控机制。以下为详细实验步骤：

一、实验前准备

1. 试剂准备

基础试剂：PBS 缓冲液（pH7.4，预冷）、16% 甲醛溶液（用于交联，需新鲜配制）、甘氨酸溶液（1.25M，用于终止交联）、细胞裂解液（Lysis Buffer，含蛋白酶抑制剂）、核裂解液（Nuclear Lysis Buffer，含蛋白酶抑制剂、SDS）、ChIP 洗涤缓冲液（低盐缓冲液、高盐缓冲液、锂盐缓冲液、TE 缓冲液，均预冷）、洗脱液（含 1% SDS、0.1M NaHCO₃）、NaCl 溶液（5M，用于解交联）、蛋白酶 K 溶液（20mg/mL）、RNase A 溶液（10mg/mL）、酚 - 氯仿 - 异戊醇混合液（25:24:1）、无水乙醇、75% 乙醇、TE 缓冲液（pH8.0，含 RNase A）。

核心试剂：特异性目标蛋白抗体（如转录因子抗体、组蛋白修饰抗体，需验证 ChIP 适用性）、阴性对照抗体（如无关 IgG）、阳性对照抗体（如 RNA 聚合酶 Ⅱ 抗体）、Protein A/G 磁珠（预洗并封闭，用于捕获抗体 - 染色质复合物）。

2. 器材准备

离心机（冷冻型，支持 12,000×g）、超声破碎仪（配备细胞破碎探头）、移液器及吸头（无 RNase/DNase）、离心管（1.5mL/15mL，无 RNase/DNase）、磁力架、恒温摇床（4℃）、恒温水浴锅、通风橱、电泳仪、凝胶成像系统、qPCR 仪（或高通量测序平台）。

3.样本预处理

细胞样本：培养对数生长期细胞，调整细胞密度至 1×10⁷ cells / 样本，收集细胞于 15mL 离心管，4℃、300×g 离心 5 分钟，弃上清，用预冷 PBS 洗涤 2 次，重悬于 1mL PBS 中（保持细胞活性）。

组织样本：取新鲜组织（50-100mg），用预冷 PBS 冲洗去除血液杂质，剪碎后加入 5mL PBS，使用组织匀浆机制成单细胞悬液，4℃、300×g 离心 5 分钟，弃上清，PBS 洗涤 2 次，重悬于 1mL PBS 中。

二、交联固定（保留 DNA - 蛋白质相互作用）

向细胞悬液中加入 16% 甲醛溶液（终浓度 1%），轻轻颠倒混匀，室温孵育 10 分钟（交联时间需优化，避免过度交联导致超声破碎困难）。

加入 1.25M 甘氨酸溶液（终浓度 0.125M），室温孵育 5 分钟，终止交联反应。

4℃、300×g 离心 5 分钟，弃上清，用预冷 PBS 洗涤细胞 2 次，每次洗涤后离心收集细胞，最终弃尽 PBS，得到交联后的细胞沉淀。

三、细胞裂解与核分离

向细胞沉淀中加入 1mL 细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上孵育 10 分钟，裂解细胞质膜。

4℃、600×g 离心 5 分钟，弃上清，收集细胞核沉淀（沉淀物为半透明絮状）。

向细胞核沉淀中加入 300μL 核裂解液（含 1% SDS、蛋白酶抑制剂），轻轻吹打混匀，冰上孵育 10 分钟，裂解核膜，释放染色质（此时溶液呈粘稠状）。

四、染色质超声破碎（获得目标长度片段）

将核裂解液转移至专用超声破碎管，置于冰浴中（超声过程中保持样本低温，避免蛋白降解）。

设置超声参数（需预实验优化，如功率 30%、超声 10 秒、间隔 20 秒、循环 10-15 次），将染色质破碎为 200-500bp 的片段（该长度适合后续免疫沉淀及 PCR 扩增）。

超声结束后，4℃、12,000×g 离心 15 分钟，取上清（含破碎后的染色质片段），即为 ChIP 样本储备液。

取 5μL 储备液，加入 1μL RNase A，37℃孵育 30 分钟，再加入 5μL 6×DNA 上样缓冲液，1% 琼脂糖凝胶电泳验证片段长度（目标条带集中在 200-500bp）。

五、免疫沉淀（富集目标蛋白结合的染色质）

取 200μL 染色质储备液，加入 800μL ChIP 稀释缓冲液（降低 SDS 浓度，避免影响抗体结合），轻轻混匀，得到染色质稀释液。

取 10μL 染色质稀释液作为 “Input 对照”（用于计算免疫沉淀效率），加入 90μL TE 缓冲液，-20℃保存备用。

向剩余染色质稀释液中加入 5μg 特异性目标蛋白抗体，阴性对照管加入 5μg 无关 IgG，阳性对照管加入 5μg 阳性对照抗体，4℃恒温摇床缓慢孵育过夜（12-16 小时，确保抗体与目标蛋白充分结合）。

提前将 Protein A/G 磁珠用 ChIP 洗涤缓冲液预洗 3 次，重悬于 50μL 洗涤缓冲液中，向各样本管中加入磁珠悬液，4℃恒温摇床孵育 2 小时，捕获抗体 - 染色质复合物。

将样本管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清，保留磁珠 - 复合物沉淀。

六、多轮洗涤（去除非特异性结合杂质）

向磁珠沉淀中加入 1mL 预冷低盐缓冲液，轻轻颠倒混匀，室温孵育 5 分钟，磁力架吸附磁珠，弃上清。

加入 1mL 预冷高盐缓冲液，重复洗涤步骤（室温孵育 5 分钟，磁力架吸附弃上清）。

加入 1mL 预冷锂盐缓冲液，重复洗涤步骤。

加入 1mL 预冷 TE 缓冲液，重复洗涤步骤（共 4 轮洗涤，确保去除未结合的染色质、游离抗体等杂质）。

最后一次洗涤后，尽量吸尽残留上清（避免杂质干扰后续实验）。

七、洗脱与解交联（释放目标 DNA 片段）

向磁珠沉淀中加入 250μL 洗脱液，轻轻吹打混匀，室温孵育 15 分钟（期间每隔 5 分钟轻轻颠倒混匀一次，促进复合物洗脱）。

磁力架吸附磁珠，将洗脱液转移至新的离心管中（此时洗脱液含抗体 - 蛋白 - DNA 复合物）。

向 Input 对照样本中加入 25μL 5M NaCl，向洗脱液样本中加入 10μL 5M NaCl，65℃恒温水浴锅孵育 4 小时（或过夜），使 DNA 与蛋白质完全解交联。

向各样本中加入 1μL RNase A（10mg/mL），37℃孵育 30 分钟，降解 RNA 杂质。

加入 1μL 蛋白酶 K 溶液（20mg/mL），45℃孵育 1 小时，降解蛋白质（包括抗体、目标蛋白及酶类）。

八、DNA 纯化回收（获得纯净目标 DNA）

向各样本中加入等体积酚 - 氯仿 - 异戊醇混合液（25:24:1），剧烈涡旋混匀 1 分钟，4℃、12,000×g 离心 10 分钟。

小心吸取上层水相（含 DNA）至新的离心管中，避免吸入中间蛋白层。

加入等体积氯仿，涡旋混匀 30 秒，4℃、12,000×g 离心 10 分钟，再次吸取上层水相（进一步去除酚类杂质）。

向水相中加入 2 倍体积无水乙醇、1/10 体积 3M NaAc（pH5.2），轻轻颠倒混匀，-20℃静置 30 分钟（或过夜），沉淀 DNA。

4℃、12,000×g 离心 15 分钟，弃上清，得到 DNA 沉淀。

加入 1mL 75% 乙醇，轻轻颠倒洗涤 DNA 沉淀，4℃、12,000×g 离心 5 分钟，弃上清。

室温倒置离心管，晾干 DNA 沉淀（避免过度干燥导致 DNA 难溶解），加入 20-50μL TE 缓冲液（含 RNase A），4℃溶解过夜（或 37℃孵育 30 分钟加速溶解）。

用 Nanodrop 检测 DNA 浓度及纯度（A260/A280 比值应在 1.8-2.0 之间，确保 DNA 纯净）。

九、检测分析（验证目标 DNA 片段）

1. qPCR 检测（定量分析结合效率）

设计目标基因结合区域的特异性引物（如转录因子结合位点上游 / 下游序列），同时设计无关区域引物作为阴性对照。

以纯化后的 IP 样本 DNA、Input 对照 DNA 为模板，进行 qPCR 反应（反应体系：2×qPCR Mix 10μL、引物各 0.5μL、DNA 模板 2μL、ddH₂O 7μL）。

反应程序：95℃预变性 5 分钟；95℃变性 10 秒，60℃退火 30 秒，72℃延伸 30 秒，40 个循环；熔解曲线分析验证引物特异性。

计算免疫沉淀效率：采用 2^(-ΔΔCt) 法，以 Input 对照为基准，比较 IP 样本与阴性对照（IgG 组）的目标区域富集倍数（富集倍数＞2 倍视为有效结合）。

2. 测序分析（ChIP-seq，全基因组筛选结合位点）

3. 

对纯化后的 DNA 样本进行文库构建（末端修复、加 A 尾、接头连接、PCR 扩增）。

文库质量检测合格后，进行高通量测序（如 Illumina 平台），获得原始测序数据。

数据处理：原始数据过滤、比对到参考基因组、峰 calling（如 MACS2 软件），筛选目标蛋白结合峰。

生物信息学分析：结合峰注释（基因启动子、增强子等区域）、GO/KEGG 功能富集分析、Motif 分析（预测目标蛋白结合基序）。

关键注意事项：

交联步骤是实验核心：甲醛终浓度需严格控制在 1%，孵育时间不宜过长（5-10 分钟），避免染色质过度交联导致超声破碎不完全；甘氨酸终止需充分，防止残留甲醛影响后续反应。

超声破碎条件需个体化优化：不同细胞 / 组织的染色质硬度不同，需通过预实验调整超声功率、时间和循环数，确保片段长度集中在 200-500bp（过长或过短都会影响 IP 效率）。

抗体选择至关重要：需使用经 ChIP 验证的特异性抗体（避免使用仅适用于 WB/IHC 的抗体），阴性对照（IgG）需与一抗物种一致，阳性对照用于验证实验体系有效性。

全程需抑制核酸酶和蛋白酶：所有裂解液、洗涤液需新鲜加入蛋白酶抑制剂，样本处理全程保持低温（冰上或 4℃），避免 DNA 降解和蛋白变性。

洗涤步骤需充分但温和：多轮洗涤可降低背景，但操作需轻柔，避免剧烈涡旋导致磁珠 - 复合物脱落；最后一次洗涤后需尽量吸尽上清，减少杂质残留。

解交联需彻底：65℃孵育时间不少于 4 小时，确保 DNA 与蛋白质完全分离，否则会影响 DNA 纯化效率和后续检测结果。

DNA 纯化过程需谨慎：酚 - 氯仿抽提时避免吸入中间蛋白层，乙醇沉淀时可加入糖原（10μg / 样本）提高低浓度 DNA 回收率。

实验对照不可缺少：Input 对照用于计算富集效率，阴性对照（IgG）用于排除非特异性结合，阳性对照用于验证实验体系稳定性，三者缺一不可。