Western Blot（WB）检测详细流程 (仅供参考)

Western Blot（蛋白质印迹法）核心是通过电泳分离蛋白质，再经免疫反应特异性检测目标蛋白，流程需严格控制每一步以确保结果准确，具体步骤如下：

1、实验前准备

2、蛋白定量与上样

3、SDS-PAGE电泳

4、转膜

5、封闭与抗体孵育

6、检测与结果分析

一、实验前准备

1. 试剂准备：配制或准备好裂解缓冲液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）、蛋白定量试剂（如BCA试剂盒）、SDS-PAGE电泳试剂（凝胶储备液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、上样缓冲液）、转膜缓冲液、封闭液（如5%脱脂牛奶）、一抗/二抗（按比例用抗体稀释液稀释）、化学发光检测底物。

2. 器材准备：电泳槽、转膜仪、硝酸纤维素膜（NC膜）或PVDF膜（需用甲醇激活）、滤纸、移液器、离心管、凝胶成像系统等。

3. 样本准备：根据样本类型（细胞/组织）处理，细胞用胰酶消化后离心收集，组织需匀浆；加入预冷的裂解缓冲液，冰上裂解30分钟，4℃、12000rpm离心15分钟，取上清即为蛋白样本。

二、蛋白定量与上样

1. 蛋白定量：按BCA试剂盒说明书操作，将标准品和样本与BCA工作液混合，37℃孵育30分钟，用酶标仪测562nm吸光度，根据标准曲线计算样本蛋白浓度。

2. 样本处理：按定量结果，取等量蛋白样本与上样缓冲液（含β-巯基乙醇）混合，100℃煮沸5-10分钟使蛋白变性，冷却后备用。

3. 凝胶制备：根据目标蛋白分子量选择分离胶浓度（小分子选高浓度，大分子选低浓度），先灌分离胶，加一层水封胶，凝固后倒掉水，再灌浓缩胶，插入梳子，待凝胶完全凝固后拔出梳子。

4. 上样：将凝胶放入电泳槽，倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中加入处理好的蛋白样本和蛋白Marker（用于分子量参考）。

三、SDS-PAGE电泳

1. 浓缩胶阶段：接通电源，设置电压为80V，电泳至溴酚蓝指示剂进入分离胶（约20-30分钟）。

2. 分离胶阶段：将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部（约60-90分钟），关闭电源，取出凝胶。

四、转膜

1. 转膜组装：按“负极→滤纸→凝胶→膜→滤纸→正极”顺序组装转膜三明治，确保各层无气泡（气泡会阻碍蛋白转移），膜的大小需与凝胶一致。

2. 转膜操作：将转膜三明治放入转膜仪，倒入预冷的转膜缓冲液，根据膜类型和蛋白分子量设置转膜条件（如PVDF膜常用200mA恒流，转膜时间30-90分钟），转膜过程中保持低温（可在转膜槽外放置冰盒）。

3. 转膜验证：转膜结束后，可将膜用丽春红染液染色5分钟，若能看到清晰的蛋白Marker条带，说明转膜成功，随后用TBST缓冲液洗去染液。

五、封闭与抗体孵育

1. 封闭：将转膜后的膜放入封闭液中，室温摇床孵育1-2小时（或4℃过夜），目的是封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景干扰。

2. 一抗孵育：弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次10分钟；加入稀释好的特异性一抗，4℃摇床孵育过夜（或室温孵育2小时），使一抗与目标蛋白特异性结合。

3. 二抗孵育：弃去一抗，用TBST洗膜3次，每次10分钟；加入稀释好的荧光标记或酶标记（如HRP）二抗，室温摇床孵育1小时，使二抗与一抗特异性结合。

4. 洗膜：弃去二抗，用TBST洗膜3次，每次10分钟，彻底去除未结合的二抗，避免影响后续检测。

六、检测与结果分析

1. 化学发光检测：将膜取出，用滤纸吸干表面液体，均匀滴加化学发光检测底物（如ECL底物），孵育1-2分钟后，放入凝胶成像系统中曝光，根据条带亮度调整曝光时间，获取清晰的蛋白条带图像。

2. 结果分析：用图像分析软件（如ImageJ）对蛋白条带进行灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（如GAPDH、β-actin）条带灰度值的比值，表示目的蛋白的相对表达量，进而分析样本中目标蛋白的表达差异。