免疫荧光（Immunofluorescence, IF）详细流程（仅供参考）

免疫荧光（IF）核心是利用特异性抗体与样本中目标抗原结合，再通过荧光标记的二抗识别一抗，最终通过荧光显微镜观察目标抗原的定位与表达，具体步骤如下：

1实验前准备

2固定与通透

3封闭

4抗体孵育

5封片与观察

一、实验前准备

1. 试剂准备：

- 基础试剂：PBS缓冲液（pH7.4）、4%多聚甲醛（固定液）、0.1%-0.3% Triton X-100（通透液，含于PBS中）、封闭液（5%胎牛血清或1% BSA，含于PBS中）、抗荧光淬灭封片剂。

- 核心试剂：特异性一抗（针对目标抗原）、荧光标记二抗（与一抗种属匹配，如Alexa Fluor系列）、DAPI（染细胞核，可选）。

2. 器材准备：荧光显微镜、载玻片、盖玻片、湿盒（防止孵育时样本干燥）、移液器及吸头、染色缸。

3. 样本预处理（以细胞爬片为例，组织切片流程类似）：

- 将细胞接种于铺有盖玻片的培养皿中，培养至适宜密度（通常60%-80%汇合度）。

- 吸弃培养基，用预冷PBS轻轻洗涤细胞2次，每次3分钟，去除残留培养基。

二、固定与通透

1. 固定：向培养皿中加入4%多聚甲醛，室温孵育15-20分钟（避免过度固定导致抗原表位遮蔽）。

2. 洗涤：吸弃固定液，用PBS洗涤样本3次，每次5分钟，充分去除残留固定液。

3. 通透：若目标抗原位于细胞内，需加入含0.1%-0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育10-15分钟，使细胞膜穿孔，便于抗体进入；若为膜表面抗原，可跳过此步。

4. 再次洗涤：用PBS洗涤样本3次，每次5分钟，去除Triton X-100。

三、封闭（阻断非特异性结合）

1. 将盖玻片取出，细胞面朝上放置于湿盒内的载玻片上，滴加足量封闭液（覆盖整个细胞面即可）。

2. 室温封闭30-60分钟（或4℃封闭过夜），阻断样本中非特异性蛋白与抗体的结合，降低背景荧光。

四、抗体孵育（特异性结合目标抗原）

1. 一抗孵育：

- 吸弃封闭液（无需洗涤），按抗体说明书比例，用封闭液稀释特异性一抗（如1:100-1:1000）。

- 向样本滴加稀释后的一抗，确保完全覆盖细胞，湿盒内4℃孵育过夜（或室温孵育1-2小时，孵育时间需根据抗体特性调整）。

- 孵育结束后，用PBS洗涤样本3次，每次5分钟，去除未结合的游离一抗。

2. 二抗孵育：

- 用封闭液稀释荧光标记二抗（按说明书比例，如1:200-1:2000，注意避光操作，防止荧光淬灭）。

- 滴加二抗，湿盒内室温避光孵育30-60分钟。

- 孵育结束后，用PBS洗涤样本3次，每次5分钟，最后一次可加入DAPI染核，室温避光孵育5分钟，再用PBS洗1次。

五、封片与观察

1. 封片：吸尽样本表面残留的PBS，在载玻片中央滴加1-2滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片细胞面朝下轻轻覆盖在封片剂上（避免产生气泡，若有气泡可轻轻按压盖玻片挤出），用指甲油封边（可选，防止封片剂干燥）。

2. 观察与成像：

- 立即用荧光显微镜观察，根据二抗和DAPI的荧光波长选择对应激发光通道（如FITC为绿色通道，Cy3为红色通道，DAPI为蓝色通道）。

- 调节焦距和曝光时间，拍摄图像，注意避免过度曝光导致荧光信号饱和。

关键注意事项

- 全程注意避光操作（从二抗孵育开始），荧光染料易受光照淬灭，影响信号强度。

- 抗体稀释需严格按说明书进行，浓度过高易导致非特异性染色，过低则可能检测不到信号。

- 洗涤步骤需充分，每次洗涤后确保吸尽液体，减少背景荧光干扰。

- 设置对照实验：空白对照（仅二抗）、阴性对照（用无关IgG替代一抗），验证结果特异性。

- 封片后若不立即观察，需将样本置于4℃避光保存，且保存时间不宜过长（通常不超过24小时）。