无荧光信号 / 信号极弱

目标细胞群无荧光，或信号接近阴性对照

1. 细胞未充分透化（胞内抗原检测时）；

2. 荧光染料淬灭 / 标记效率低；

3. 细胞浓度过低或抗原表达量低；

4. 抗体失效 / 种属不匹配 / 稀释度过高；

1. 胞内染色时用 0.1% Triton X-100 透化 10~15min，膜蛋白检测省略透化；

2. 全程避光操作，选用高活性荧光染料；

3. 浓缩细胞至 1×10⁶~1×10⁷个 /mL，或使用信号放大试剂；

4. 验证抗体有效性，优化稀释比（1:50~1:200），匹配靶细胞种属；

非特异性背景高

阴性细胞群荧光信号偏高，群分不清晰

1. 抗体浓度过高 ；

2. 封闭不充分（Fc 受体结合干扰）；

3. 细胞碎片 / 死细胞过多，非特异性吸附抗体；

4. 洗涤不彻底，残留未结合抗体

1. 降低抗体浓度；

2. 用 1% BSA 或种属匹配血清封闭 15~20min，Fc 受体阳性细胞加 Fc 阻断剂；

3. 实验前用尼龙网过滤细胞，加台盼蓝 / 7-AAD 排除死细胞；

4. 洗涤用含 2% FBS 的 PBS，离心后弃净上清，重复 3 次

细胞聚集（成团）

散点图出现大量团块信号，无法准确圈门

1. 细胞消化过度 / 不足（贴壁细胞）；

2. 吹打力度过轻，细胞未充分分散；

3. 离心速度过高，细胞挤压成团；

4. 抗体孵育时未充分混匀

1. 优化消化条件（如胰酶消化至细胞边缘收缩），避免消化过度；

2. 用巴氏吸管轻柔吹打细胞，或过 200 目筛网；

3. 降低离心速度（300~400×g，5min）；

4. 抗体孵育时涡旋轻柔混匀，或置于摇床低速振荡

分辨率低，细胞群分不明显

目标群与杂群重叠，无法区分

1. 荧光补偿设置不当；

2. 激光功率过低，信号检测灵敏度不足；

3. 抗体荧光素光谱重叠；

4. 细胞培养状态差，抗原表达不均

1. 用单染管调整荧光补偿，消除通道间干扰；

2. 适当提高激光功率（避免过度损伤细胞）；

3. 选用发射光谱无重叠的荧光素组合（如 FITC/PE/Cy5）；

4. 选用对数生长期细胞，标准化培养条件

细胞存活率低

上机检测时死细胞比例＞20%

1. 样本处理时间过长，细胞缺氧受损；

2. 离心 / 吹打操作剧烈，机械损伤细胞；

3. 染色液渗透压不适，细胞破裂；

4. 抗体 / 试剂毒性作用

1. 缩短样本处理时间（＜2h），全程冰上操作；

2. 轻柔吹打，离心速度不超过 500×g；

3. 使用等渗 PBS 配制染色液，避免高浓度试剂；

4. 选用低毒抗体，优化孵育时间（15~30min）

实验重复性差

不同批次检测结果差异大，细胞比例波动明显

1. 染色温度 / 时间不一致；

2. 上机流速不稳定，数据采集误差；

3. 细胞起始状态不同（代次 / 密度差异）

1.固定染色条件（4℃孵育 30min，避光）；

2. 上机前校准仪器，保持流速稳定（100~300 个 / 秒）；

3. 选用相同代次、对数生长期的细胞