无信号或信号极弱

1. 初始样品量过少；

2. 组织 / 细胞破碎不充分，蛋白未完全释放;

3. 提取缓冲液体积过多，导致蛋白被过度稀释；

4. 蛋白吸附到离心管、匀浆器等容器壁；

5. 提取过程中蛋白发生降解

1. 适当增加样品量，确保组织 / 细胞总量满足提取需求；

2. 优化破碎方式：组织样本使用玻璃匀浆器充分研磨，细胞样本可结合超声破碎（功率 300~500W，超声 3~5 次，每次 10~20s，间隔 30s）；

3. 调整样品与提取缓冲液比例（建议 1:3~1:5，如 100mg 组织加入 300~500μL 缓冲液）；

4. 使用硅化处理的离心管，提取缓冲液中加入 0.1%~0.5% Triton X-100 减少蛋白吸附；

5. 全程冰上操作，提取缓冲液中添加新鲜蛋白酶抑制剂（如 PMSF 终浓度 1mM，蛋白酶抑制剂鸡尾酒 1:100 稀释）

多条杂带，目标条带模糊、弥散，或分子量低于预期

1. 提取缓冲液未加或加入失效的蛋白酶抑制剂；

2. 样品反复冻融（超过 3 次），导致蛋白结构破坏、降解；

3. 提取、离心过程温度过高（未在 4℃或冰上操作）；

4. 样品处理时间过长，蛋白酶持续作用

1. 提取前新鲜添加蛋白酶抑制剂，对于易降解蛋白可额外加入磷酸酶抑制剂；

2. 样品提取后分装（每管 50~100μL），-80℃冻存，避免反复冻融；

3. 离心机预冷至 4℃，所有操作在冰上进行，缩短样品暴露在室温的时间；

4. 优化处理流程，样品裂解后尽快离心（12000rpm，4℃，10~15min）取上清，避免长时间放置

拖尾或块状条带

1. 蛋白浓度过高（超过 5mg/mL），导致分子间相互作用聚集；

2. 提取缓冲液离子强度不适（过高或过低）

3. 还原剂（β- 巯基乙醇、DTT）失效，蛋白二硫键未被打开，形成聚集体；

4. 样品煮沸时间过长（超过 15 分钟），导致蛋白变性过度聚集

1. 适当稀释样品（浓度调整至 1~3mg/mL），或减少上样量；

2. 使用标准配方的提取缓冲液（如 RIPA 缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，1% Triton X-100），确保离子强度稳定；

3. 新鲜添加还原剂（β- 巯基乙醇终浓度 5%，或 DTT 终浓度 100mM），还原剂需避光保存；

4. 样品煮沸 5~10 分钟即可，煮沸后置于冰上冷却 5 分钟再上样；5. 对于难溶解的膜蛋白，可在缓冲液中加入 2% SDS 或 1% NP-40 辅助溶解

电泳后条带呈微笑状，或条带边缘不整齐、倾斜

1. 凝胶配制不均匀（丙烯酰胺浓度不一致），导致电场分布不均；

2. 电泳缓冲液浓度过高或过低（如 Tris - 甘氨酸缓冲液应稀释 10 倍使用）；

3. 上样量过多（每孔超过 20μL），样品溢出或拥挤；

4. 电泳电压 / 电流过高，导致凝胶发热、变形；

5. 梳子插入过深或过浅，加样孔形状不规则

1. 配制凝胶时充分搅拌，确保丙烯酰胺与双丙烯酰胺混合均匀，聚合前避免剧烈晃动；

2. 按说明书稀释电泳缓冲液，使用新鲜配制的缓冲液（避免反复使用超过 3 次）；

3. 控制上样量（每孔 10~20μL，蛋白总量 20~50μg），若样品量多可分多次上样；

4. 采用恒压电泳（浓缩胶 80V，分离胶 120V），避免电压过高，电泳槽外可放置冰袋降温；

5. 梳子插入凝胶时预留 1~2mm 距离，确保加样孔平整，拔梳时动作轻柔

条带呈弥散状，或拖尾

1. 样品中盐浓度过高，导致电泳时电场紊乱；

2. Loading Buffer 添加不足或失效（如溴酚蓝褪色）；

3. 凝胶浓度与目标蛋白分子量不匹配（如小分子蛋白用高浓度凝胶，大分子蛋白用低浓度凝胶）；

4. 电泳时间过长，条带跑出凝胶；

5. 蛋白未完全变性（如煮沸不充分）

1. 若样品盐浓度高，可通过透析或超滤法脱盐，或减少上样量；

2. 确保 Loading Buffer 与样品比例为 1:4（如 40μL 样品加 10μL 5×Loading Buffer），使用新鲜配制的 Loading Buffer；

3. 根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度：小分子（<30kDa）用 12%~15% 分离胶，中分子（30~100kDa）用 8%~12% 分离胶，大分子（>100kDa）用 6%~8% 分离胶；

4. 电泳前计算大致时间，避免条带跑出（可通过溴酚蓝指示，溴酚蓝到达凝胶底部 1~2cm 时停止电泳）；

5. 样品煮沸 5~10 分钟，确保蛋白完全变性，煮沸后冰浴冷却

转膜不完全

1. 转膜时间 / 电压 / 电流不足；

2. 转膜三明治存在气泡（接触不良）；

3. 转膜缓冲液配方 / 浓度异常；

4. 膜孔径选择错误；

5. 凝胶与膜位置颠倒

1. 按蛋白分子量调整转膜参数（<30kDa：100V/20-30min；30-100kDa：100V/40-60min；>100kDa：100V/60-90min）；

2. 转膜前浸泡组件，逐层排除气泡；

3. 使用标准缓冲液（25mM Tris+192mM 甘氨酸 + 20% 甲醇）；

4. 小分子选 0.2μm 膜，中大分子选 0.45μm 膜；5. 正确组装：阴极→滤纸→凝胶→膜→滤纸→阳极

转膜过度

1. 转膜时间过长 / 电压 / 电流过高；

2. 膜孔径过大；

3. 缓冲液甲醇浓度过高（>30%）

1. 缩短转膜时间，降低电压 / 电流（如 100V 降至 80V）；

3. 更换更小孔径膜（小分子换 0.2μm）；

3. 调整甲醇浓度至 20%

膜上条带模糊 / 高背景

1. 转膜温度过高（未降温）；

2. 膜 / 凝胶 / 滤纸大小不匹配；

3. 转膜缓冲液陈旧；

4. PVDF 膜未用甲醇激活

1. 转膜时冰浴降温（控制 4℃左右）；

2. 确保组件大小一致（膜略大于凝胶）；

3. 使用新鲜配制的缓冲液；

4. PVDF 膜用甲醇浸泡 10-30 秒激活（NC 膜无需）

无目标条带（孵育环节）

1. 一抗 / 二抗失效或浓度过低；

2. 抗体与样品种属 / 抗原不匹配；

3. 孵育时间 / 温度不当；

4. 封闭过度掩盖抗原表位；5. 洗膜过度导致抗体脱落

1. 按说明书调整抗体稀释比（一抗 1:500~1:10000，二抗 1:10000~1:50000），分装冻存避免反复冻融；

2. 确认抗体种属特异性与抗原匹配性；

3. 优化孵育条件（一抗 4℃过夜或 37℃1~2h，二抗 37℃1h 或室温 2h）；

4. 用 5% 脱脂奶粉 / 3% BSA 封闭 1~2h（室温），避免高浓度 / 长时间封闭；5. 用含 0.1% Tween-20 的 TBST 洗膜 3 次（每次 5~10min）

背景过高（非特异性条带多）

1. 一抗 / 二抗浓度过高；

2. 封闭不充分（液种不当 / 时间短）；

3. 抗体交叉反应；

4. 洗膜不彻底；

5. 孵育 / 洗膜时膜干燥

1. 降低抗体浓度（如一抗 1:500 改为 1:1000）；

2. 按需选封闭液（蛋白类用 5% 脱脂奶粉，磷酸化蛋白用 3% BSA），室温封闭 2h；

3. 选单克隆一抗，二抗匹配一抗种属；

4. 用含 0.1%~0.2% Tween-20 的 TBST 洗膜 4~5 次（每次 10min）；

5. 全程确保膜浸泡在液体中

条带不均一

1. 抗体孵育未摇匀，分布不均；

2. 封闭液 / 抗体有沉淀；

3. 膜与抗体溶液接触不良；

4. 洗膜水流冲击导致局部抗体脱落

1. 孵育时用摇床（50~100rpm）摇匀，确保抗体覆盖膜；

2. 试剂使用前 10000rpm 离心 5min 去沉淀；

3. 按每 cm² 膜≥100μL 准备抗体溶液，选合适孵育容器；

4. 洗膜时轻晃容器，避免水流直冲击膜

无显色信号 / 信号极弱

1. 发光底物失效（过期 / 未避光保存）；

2. 底物孵育时间不足；

3. 叠氮钠抑制 HRP 酶活性；

4. 曝光时间过短

1. 使用有效期内发光底物，避光冷藏保存；

2. 底物充分浸泡膜，室温孵育 1~5min；

3. 封闭 / 洗膜液避免加叠氮钠；

4. 延长曝光至 1~5min，或换高灵敏度底物

背景发亮（无清晰条带）

1. 发光底物过量 / 孵育过久；

2. 二抗浓度过高 / 洗膜不充分；

3. 膜上残留蛋白 / 抗体沉淀

1. 底物孵育后轻吸膜表面多余液体，缩短孵育至 1~2min；

3. 降低二抗浓度，增加洗膜次数；

3. 试剂使用前离心去除沉淀

条带拖尾 / 晕圈

1. 底物未吸干导致扩散；

2. 转膜时蛋白扩散；

3. 抗体浓度过高致非特异性结合

1. 吸干膜表面多余底物，避免扩散；

2. 优化转膜条件（缩短时间 / 降低电压）；

3. 降低一抗 / 二抗浓度