无目的蛋白沉淀 / 信号弱

1. 蛋白相互作用弱 / 短暂（未及时固定）；

2. 裂解液成分不当（去垢剂浓度过高 / 过低）；

3. 洗涤过度导致复合物解离；

4. 蛋白表达量极低

5. 抗体浓度过低；

1. 加入交联剂（如 DSP）固定相互作用，全程冰上操作；

2. 调整裂解液去垢剂浓度（0.1%~1% Triton X-100），加入蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂；

3. 减少洗涤次数（3~4 次），降低洗涤缓冲液盐浓度；

4. 富集样本或使用高灵敏度检测方法

5. 优化抗体稀释比例（1:50~1:200）；

非特异性背景高（杂带多）

1. 封闭不充分；

2. 洗涤不彻底；

3. 蛋白样品降解；

4. beads 非特异性吸附

5. 抗体可能非特异性结合；

1. 用 5% BSA 或脱脂奶粉封闭 beads 1~2h；

2. 增加洗涤次数（4~5 次），使用含 0.1% Tween-20 的洗涤缓冲液；

3. 全程冰上操作，添加新鲜抑制剂；

4. 预孵育 beads 与无关蛋白（如 BSA），减少非特异性吸附

5. 设置 IgG 同型对照；

共沉淀蛋白未检测到

1. 蛋白相互作用条件未满足（如需要辅因子）；

2. 裂解液破坏蛋白复合物；

3. 检测抗体灵敏度不足；

4. 孵育时间 / 温度不当

1. 模拟生理条件（添加必要辅因子、调整 pH 值）；

2. 降低裂解液去垢剂强度，使用温和裂解液（如 NP-40 裂解液）；

3. 放大检测信号；

4. 4℃孵育过夜，确保相互作用充分发生

beads 聚集 / 沉淀不完全

1. beads 浓度过高；

2. 抗体与 beads 结合不充分；

3. 孵育时未充分摇匀；

4. 离心速度 / 时间不足

1. 调整 beads 用量（每样品 20~50μL）；

2. 抗体与 beads 先室温孵育 1~2h，再加入样品；

3. 孵育时置于摇床上缓慢摇匀（50~100rpm）；

4. 增加离心速度（10000~12000rpm）或延长离心时间（5~10min）

蛋白降解

1. 裂解液中未加 / 加了失效的抑制剂；

2. 样本处理时间过长；

3. 操作温度过高；

4. 反复冻融样品

1. 新鲜添加蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂鸡尾酒；

2. 缩短样本处理时间（<2h）；

3. 全程冰上或 4℃操作；

4. 样品分装冻存，避免反复冻融

假阳性结果（错误共沉淀）

1. 抗体交叉反应；

2. beads 非特异性吸附强；

3. 样品中存在蛋白聚合体；

4. 洗涤缓冲液盐浓度过低

1. 验证抗体特异性，使用交叉吸附抗体；

2. 优化封闭和预孵育步骤；

3. 裂解液中加入还原剂（如 DTT），避免蛋白聚合；

4. 适当提高洗涤缓冲液盐浓度（150~300mM NaCl）