免疫组织化学（IHC）染色详细流程（仅供参考）

免疫组织化学（IHC）核心是利用抗原与抗体的特异性结合，通过显色剂（如DAB）标记目标抗原，实现组织切片中特定蛋白的定位与表达水平分析，流程需严格控制脱蜡、抗原修复等关键步骤以保障结果可靠性，具体步骤如下：

1实验前准备

2石蜡切片脱蜡与水化

3阻断内源性过氧化物酶

4抗原修复

5封闭与抗体孵育

6显色与复染

7脱水、透明与封片

8结果观察与分析

一、实验前准备

1. 试剂准备：

- 基础试剂：二甲苯（脱蜡用）、梯度乙醇（100%、95%、85%、75%，用于脱蜡后复水）、PBS缓冲液（pH7.4，洗片用）、3% H₂O₂溶液（阻断内源性过氧化物酶）。

- 核心试剂：抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液pH6.0或EDTA缓冲液pH8.0，根据抗体选择）、封闭液（5% BSA或正常山羊血清）、一抗（按说明书稀释）、HRP标记二抗（按说明书稀释）、DAB显色液、苏木素染液（复染细胞核）、脱水透明试剂（梯度乙醇、二甲苯）、中性树胶（封片用）。

2. 器材准备：组织切片（石蜡切片或冰冻切片）、切片架、染色缸、湿盒、移液器、显微镜、盖玻片、吸水纸。

3. 切片预处理：石蜡切片需在60℃烤箱中烘烤1-2小时（增强切片与载玻片结合，防止脱片）；冰冻切片需在室温放置30分钟或4℃过夜干燥。

二、石蜡切片脱蜡与水化（冰冻切片跳过此步）

按以下顺序依次浸泡切片，每步5-10分钟，确保脱蜡彻底：

1. 二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ（去除石蜡）；

2. 100%乙醇Ⅰ → 100%乙醇Ⅱ → 95%乙醇 → 85%乙醇 → 75%乙醇（逐步水化，避免组织收缩）；

3. 双蒸水浸泡5分钟（洗去乙醇，为后续步骤做准备）。

三、阻断内源性过氧化物酶

将切片放入3% H₂O₂溶液（用甲醇或PBS配制），室温避光孵育10-15分钟，目的是抑制组织自身过氧化物酶活性，避免干扰后续DAB显色。孵育后用PBS缓冲液洗片3次，每次3分钟。

四、抗原修复（关键步骤）

目的是暴露被甲醛固定掩盖的抗原表位，确保抗体有效结合，根据抗体说明书选择修复方式：

1. 热修复法（最常用）：

- 将切片放入抗原修复液中，置于微波炉或高压锅中加热。

- 微波炉：中高火加热至沸腾，断电后焖5分钟，重复2-3次，自然冷却至室温。

- 高压锅：加热至喷气，保持1-2分钟，关火后自然放气，冷却至室温。

2. 酶修复法（适用于部分抗原）：将切片放入胰蛋白酶或胃蛋白酶溶液中，37℃孵育10-30分钟，用PBS洗片终止反应。

3. 修复后用PBS洗片3次，每次3分钟。

五、封闭与抗体孵育

1. 封闭：用吸水纸吸干切片周围水分（避免抗体稀释），在组织区域滴加封闭液，室温孵育30-60分钟，阻断非特异性结合位点，减少背景染色。

2. 一抗孵育：弃去封闭液（无需洗片），滴加按比例稀释好的特异性一抗，将切片放入湿盒（防止抗体蒸发），4℃孵育过夜（推荐，结合更充分）或室温孵育2小时。

3. 洗片与二抗孵育：

- 一抗孵育后，用PBS洗片3次，每次5分钟，彻底去除未结合的一抗。

- 滴加HRP标记的二抗（与一抗种属匹配），室温湿盒内孵育30-60分钟。

- 二抗孵育后，再次用PBS洗片3次，每次5分钟。

六、显色与复染

1. DAB显色：将切片取出，吸干周围水分，滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下实时观察显色情况（通常1-5分钟），当目标区域出现清晰棕黄色信号、背景较浅时，立即用双蒸水冲洗终止显色。

2. 苏木素复染：将切片放入苏木素染液中，室温染色3-5分钟（染细胞核，呈蓝色，与棕黄色抗原信号对比），用流水冲洗10分钟（返蓝，使细胞核颜色更清晰）。

七、脱水、透明与封片

按以下顺序依次浸泡切片，每步3-5分钟，完成脱水与透明：

1. 75%乙醇 → 85%乙醇 → 95%乙醇 → 100%乙醇Ⅰ → 100%乙醇Ⅱ（逐步脱水，防止组织变形）；

2. 二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ（透明，使切片与盖玻片间的树胶更好融合）。

3. 封片：取出切片，吸干多余二甲苯，在组织中央滴加1-2滴中性树胶，轻轻盖上盖玻片（避免产生气泡），室温放置数小时或37℃烤箱烘烤30分钟，待树胶凝固。

八、结果观察与分析

1. 观察：在光学显微镜下观察切片，阳性信号呈棕黄色，根据信号在细胞内的定位（细胞核、细胞质或细胞膜）判断是否为目标抗原。

2. 分析：

- 定性分析：判断组织中目标抗原“阳性”或“阴性”表达。

- 半定量分析：根据阳性细胞比例和染色强度（弱阳、中阳、强阳）进行评分，统计不同样本的表达差异。