免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）详细Protocol (仅供参考)

免疫沉淀（IP）核心是利用特异性抗体与目标蛋白结合，再通过 Protein A/G 等介质捕获抗体-抗原复合物，从而从复杂样本中分离纯化目标蛋白，具体步骤如下：

1实验前准备

2抗体与 Protein A/G 珠偶联

3抗原捕获

4洗脱目标蛋白

5后续检测

一、实验前准备

1. 试剂准备：

- 基础试剂：细胞裂解液（如 RIPA 裂解液，含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解/去磷酸化）、PBS（pH7.4）、洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS，去除非特异性结合）、2×SDS 上样缓冲液。

- 核心试剂：特异性一抗（针对目标蛋白）、阴性对照抗体（如无关 IgG，排除非特异性结合）、Protein A/G 磁珠/琼脂糖珠（用于捕获抗体-抗原复合物）。

2. 器材准备：离心机、移液器及吸头、离心管/EP 管、磁力架（磁珠专用）、摇床、蛋白定量试剂盒（如 BCA 试剂盒）。

3. 样本预处理：

- 细胞样本：收集对数期细胞，用预冷 PBS 洗涤 2 次，弃尽 PBS 后加入预冷的裂解液（每 1×10⁶ 细胞加 100-200μL），冰上裂解 30 分钟，4℃、12000rpm 离心 15 分钟，取上清（即总蛋白提取物），BCA 法测定蛋白浓度。

- 组织样本：将组织剪碎，加入预冷裂解液（每 50mg 组织加 500μL），匀浆后冰上裂解 30 分钟，后续同细胞样本离心取上清。

二、抗体与 Protein A/G 珠偶联（形成“抗体-珠”复合物）

1. 取适量 Protein A/G 磁珠（每 500μg 总蛋白用 20-50μL 磁珠），加入 500μL 预冷 PBS，轻轻颠倒混匀，磁珠吸附后弃上清（琼脂糖珠需 4℃、3000rpm 离心 3 分钟收集），重复洗涤 2 次。

2. 向洗涤后的磁珠中加入特异性一抗（按抗体说明书用量，通常 1-5μg），阴性对照孔加入等量无关 IgG，再补加 PBS 至 200μL，4℃ 摇床缓慢孵育 1-2 小时（或室温孵育 30 分钟），使抗体与磁珠充分结合。

3. 孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤磁珠 3 次，每次 500μL，去除未结合的游离抗体，最后一次洗涤后弃尽上清，备用。

三、抗原捕获（“抗体-珠”复合物结合目标蛋白）

1. 取总蛋白提取物（通常 200-500μg 蛋白），用裂解液补至体积 500μL，加入上述制备好的“抗体-珠”复合物，4℃ 摇床缓慢孵育 4-6 小时（或过夜，确保抗原充分结合）。

2. 孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤复合物 4-5 次，每次 500μL（磁珠用磁力架吸附，琼脂糖珠离心收集），最后一次洗涤后尽量吸尽上清（避免残留杂质影响后续检测）。

四、洗脱目标蛋白

1. 向洗涤后的“抗体-珠-抗原”复合物中加入 20-50μL 2×SDS 上样缓冲液，轻轻吹打混匀。

2. 沸水浴加热 5-10 分钟（或 95℃ 加热 15 分钟），使目标蛋白从复合物中解离。

3. 磁珠样本：磁力架吸附磁珠，取上清（含目标蛋白）；琼脂糖珠样本：4℃、12000rpm 离心 5 分钟，取上清。

五、后续检测（以 Western Blot 为例）

1. 将洗脱的蛋白样本上样至 SDS-PAGE 凝胶，进行电泳分离。

2. 转膜、封闭后，用目标蛋白的特异性一抗（可与 IP 所用一抗相同或针对不同表位）孵育，再用 HRP 标记二抗孵育。

3. 显影曝光，观察目标蛋白条带（阴性对照 IgG 组应无明显条带，排除非特异性结合）。

关键注意事项

- 所有试剂需预冷，操作全程在冰上或 4℃ 进行，减少蛋白降解。

- 裂解液中必须加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂，根据目标蛋白（如磷酸化蛋白需加磷酸酶抑制剂）调整。

- 阴性对照（无关 IgG）和阳性对照（已知含目标蛋白的样本）需同步设置，确保实验结果可靠。

- 磁珠/琼脂糖珠洗涤需充分，避免残留的游离抗体干扰 Western Blot 结果。