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问题类型 | 现象描述 | 核心原因 | 解决方案 |
标准曲线无梯度 / 线性差 | 标准品检测值无明显浓度依赖，R²＜0.98 | 1. 标准品降解或稀释错误；
2. 包被液 pH 不适（偏离抗原等电点）；
3. 孵育温度 / 时间失控；
4. 底物反应不充分 | 1. 标准品分装冻存，避免反复冻融，严格按倍比稀释；
2. 调整包被液 pH（常用 0.05M 碳酸盐缓冲液，pH9.6）；
3. 4℃包被过夜，37℃孵育标准品 1~2h；
4. 底物室温避光反应 15~30min，及时终止 |
空白孔 OD 值过高 | 空白孔（无抗原 / 抗体）OD 值显著高于正常阈值 | 1. 酶标二抗浓度过高或非特异性结合；
2. 封闭不充分（封闭液选择不当 / 时间短）；
3. 洗涤不彻底，残留酶标试剂；
4. 底物自身显色或污染 | 1. 降低二抗浓度，选用交叉吸附二抗；
2. 用 5% 脱脂奶粉或 BSA 封闭 1~2h（室温）；
3. 洗涤液含 0.05% Tween-20，洗板 5~6 次，每次 30s；
4. 选用新鲜底物，避免试剂污染 |
样品 OD 值偏低 / 无信号 | 样品检测值接近空白，低于检出限 | 1. 抗原 / 抗体浓度过低或失效；
2. 包被效率低（抗原未吸附到板上）；
3. 孵育时间不足或温度过低；
4. 底物失效或终止过早 | 1. 优化抗原 / 抗体浓度，验证试剂有效期；
2. 增加包被抗原用量，4℃包被过夜；
3. 37℃孵育样本 2h 或 4℃过夜；
4. 使用有效期内底物，严格控制反应时间 |
重复性差（孔间 / 板间差异大） | 同浓度样本孔间 OD 值变异系数（CV）＞10% | 1. 加样体积不均一；
2. 洗板时孔间液体残留差异；
3. 孵育时酶标板受热不均；
4. 底物加样顺序混乱 | 1. 使用多道移液器，加样后轻拍混匀；
2. 洗板后倒扣拍干，避免孔底残留液体；
3. 孵育时密封酶标板，置于恒温孵箱；
4. 底物按同一顺序快速加样 |
钩状效应（高浓度样本 OD 值低） | 高浓度抗原样本 OD 值低于中浓度样本 | 抗原浓度过高，导致抗原与固相抗体、酶标抗体分别结合，无法形成夹心复合物 | 1. 对高浓度样本进行梯度稀释后再检测；
2. 降低包被抗体浓度，优化反应体系比例；
3. 缩短抗原与抗体的孵育时间 |
非特异性显色（背景高） | 整板显色均匀，样本孔与空白孔差异小 | 1. 抗体可能非特异性结合；
2. 封闭液与抗原存在交叉反应；
3. 洗涤液浓度过低；
4. 温育时湿度不足，板孔边缘干燥 | 1. 优化抗体；
2.更换封闭液（如 BSA 替代脱脂奶粉）；
3.提高洗涤液中 Tween-20 浓度至 0.1%；
4. 孵育时板内加湿纱布，防止边缘效应 |
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