流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）详细实验步骤（仅供参考）

流式细胞术（FCM）是一种高通量分析技术，利用荧光标记抗体与细胞中目标分子（如表面抗原、胞内蛋白）特异性结合，当细胞穿过激光束时，检测并定量单个细胞的荧光信号，可快速分析细胞表型、活性及功能状态。

以下为详细实验步骤（以表面抗原免疫表型分析为例）：

一、实验前准备

1. 试剂准备

基础试剂：磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）、胎牛血清（FBS，用于封闭非特异性结合）、细胞消化液（如无 EDTA 胰酶，适用于贴壁细胞）、7 - 氨基放线菌素 D（7-AAD，用于活性染色）、固定液（4% 多聚甲醛，胞内染色时使用）、通透液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS，胞内染色时使用）。

核心试剂：荧光标记一抗（如 FITC/PE/APC 标记的目标表面抗原特异性抗体）、同型对照抗体（与一抗物种及荧光素一致，用于排除非特异性结合）、荧光标记二抗（使用未标记一抗时需搭配）。

2. 器材准备

流式细胞仪（配备对应荧光素检测激光）、离心机、移液器及吸头、流式管（12×75mm 聚苯乙烯管）、生物安全柜、培养箱（37℃，5% CO₂）。

3. 样本预处理

悬浮细胞：收集对数生长期细胞，4℃、300×g 离心 5 分钟，弃上清。预冷 PBS 洗涤 2 次，用含 2% FBS 的 PBS 重悬，调整细胞浓度至 1×10⁶ cells/mL。

贴壁细胞：弃去培养基，预冷 PBS 洗涤 1 次。加入适量细胞消化液，37℃孵育 2-5 分钟至细胞脱落。用完全培养基终止消化，转移至流式管，4℃、300×g 离心 5 分钟。预冷 PBS 洗涤 2 次，用含 2% FBS 的 PBS 重悬，调整细胞浓度至 1×10⁶ cells/mL。

组织来源细胞：将组织剪碎，用胶原酶 / 胰酶混合液 37℃消化 30-60 分钟，经 70μm 细胞滤网过滤获得单细胞悬液。后续离心洗涤步骤同前，调整细胞浓度至 1×10⁶ cells/mL。

二、封闭非特异性结合

向每个流式管中加入 100μL 细胞悬液（约 1×10⁵个细胞）。

每管加入 5-10μL FBS（或 Fc 受体特异性封闭液），轻轻混匀。

室温孵育 15-20 分钟（或 4℃孵育 30 分钟），封闭细胞表面 Fc 受体，减少非特异性抗体结合。

三、抗体孵育

1. 表面抗原染色

每管加入适量荧光标记一抗（按说明书操作，如 1×10⁵个细胞加入 1-5μL）。

同型对照管加入等体积同型对照抗体（与一抗物种及荧光素匹配）。

轻轻涡旋混匀，4℃避光孵育 30-60 分钟（避光防止荧光素淬灭）。

孵育结束后，每管加入 2mL 预冷 PBS，4℃、300×g 离心 5 分钟，弃上清。重复洗涤 2 次，去除未结合的游离抗体。

2. 胞内抗原染色（可选）

表面抗原染色及洗涤后，每管加入 100μL 4% 多聚甲醛固定液，室温孵育 15-20 分钟固定细胞。

500×g 离心 5 分钟，弃上清。PBS 洗涤 1 次。

加入 100μL 通透液，室温孵育 10-15 分钟通透细胞膜。

500×g 离心 5 分钟，弃上清。用含 2% FBS 的 PBS 洗涤 1 次。

加入胞内抗原特异性荧光标记一抗，4℃避光孵育 30-60 分钟。

PBS 洗涤 2 次，重悬细胞待检测。

四、活性染色（可选）

最终洗涤后，用 100μL 预冷 PBS 重悬细胞。

每管加入 1-2μL 7-AAD 染色液，轻轻混匀。

室温避光孵育 5-10 分钟（7-AAD 结合死细胞 DNA，可排除死细胞干扰）。

五、流式上机样本制备

染色后的细胞 4℃、300×g 离心 5 分钟，弃上清。

用 300-500μL 预冷 PBS（或鞘液）重悬细胞，获得单细胞悬液（避免细胞团聚堵塞流式细胞仪喷嘴）。

将细胞悬液经 40-70μm 细胞滤网过滤至新的流式管（去除团块及杂质，保证检测准确性）。

样本上机前置于冰上避光保存（1 小时内完成检测，维持细胞活性及荧光素稳定性）。

六、流式细胞仪操作与数据采集

提前 30-60 分钟开启流式细胞仪，预热激光并稳定系统。

用标准微球（如荧光校准微球）校准仪器，确保荧光信号检测准确性及补偿设置合理性。

设置检测参数：根据抗体荧光素选择对应激光及检测器（如 FITC：488nm 激光，530nm 发射光；PE：488nm 激光，575nm 发射光；APC：633nm 激光，660nm 发射光）。

调整前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）参数，圈选目标细胞群体（如根据 FSC/SSC 散点图排除碎片及死细胞）。

将样本管放入流式细胞仪，设置采集体积或事件数（每样本通常采集 10,000-50,000 个事件，保证统计显著性）。

依次采集所有样本（包括同型对照、未染色对照及单染补偿对照），数据以 FCS 格式保存。

七、数据分析

使用流式分析软件（如 FlowJo、FCS Express）打开采集的 FCS 数据。

圈门策略：

首先通过 FSC vs SSC 圈选总细胞群体，排除碎片及细胞团块。

对于活性染色样本，通过 7-AAD vs FSC 圈选活细胞（排除 7-AAD 阳性死细胞）。

以同型对照设置阳性染色阈值（同型对照阳性率通常为 1-2%）。

定量分析：计算各目标抗原阳性细胞百分比及阳性细胞平均荧光强度（MFI，反映目标分子表达水平）。

统计分析：使用统计软件（如 GraphPad Prism）比较实验组间阳性细胞百分比或 MFI 差异，生成散点图、直方图或等高线图可视化结果。

关键注意事项：

实验操作中所有试剂及样本需置于冰上或 4℃环境（特定孵育步骤除外），维持细胞活性并防止抗原降解。

荧光抗体对光敏感，所有孵育及样本处理步骤需在避光条件下进行或使用不透光试管，避免荧光素淬灭。

同型对照、未染色对照及单染补偿对照是校正非特异性结合及设置补偿的关键（多色流式实验必需）。

细胞浓度及悬液质量至关重要：避免细胞浓度过高（易导致团聚）或过低（降低数据可靠性）。

多色染色时，需选择荧光素无重叠的抗体组合，并进行补偿校准，消除通道间荧光溢出。

严格遵循流式细胞仪操作规程，实验结束后清洁仪器，防止喷嘴堵塞及交叉污染。