酶联免疫吸附试验（ELISA）详细Protocol （仅供参考）

酶联免疫吸附试验（ELISA）核心是利用抗原与抗体的特异性结合，通过酶标记抗体催化底物显色，将免疫反应信号转化为可定量的颜色信号，常用方法为双抗体夹心法（适用于检测大分子抗原），具体步骤如下：

1 实验前准备

2 加样（标准品与待检样本）

3 加酶标检测抗体

4 洗涤与显色

5 终止反应与读数

6 结果分析

一、实验前准备

1. 试剂准备：

- 基础试剂：包被缓冲液（常用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液）、洗涤液（含0.05% Tween-20的PBS，即PBST）、封闭液（5%脱脂奶粉或1% BSA的PBST）、底物液（TMB显色液，需避光）、终止液（2N H₂SO₄）。

- 核心试剂：特异性捕获抗体（一抗）、酶标检测抗体（HRP标记二抗，与捕获抗体针对抗原不同表位）、标准品（已知浓度的目标抗原，用于制作标准曲线）、待检样本（如血清、细胞上清等，需提前稀释）。

2. 器材准备：96孔酶标板、移液器及吸头、酶标仪、恒温培养箱、洗板机（或手动洗板瓶）、保鲜膜。

3. 样本预处理：待检样本需离心去除杂质（如血清3000rpm离心5分钟），并根据预实验结果用PBST稀释至合适浓度（避免信号过强或过弱）。

二、加样（标准品与待检样本）

1. 标准品梯度稀释：用PBST将标准品稀释为7个梯度浓度，确保浓度范围覆盖待检样本预期值。

2. 向酶标板孔中加入样本：

- 标准品孔：每孔100μL对应浓度的标准品，每个浓度做2-3个复孔（减少误差）。

- 待检样本孔：每孔100μL稀释后的待检样本，同样做2-3个复孔。

- 空白孔：加100μL PBST。

3. 封板后37℃孵育1-2小时，使抗原（标准品/待检样本）与孔壁上的捕获抗体充分结合。

三、加酶标检测抗体

1. 弃去孔内液体，PBST洗涤3次，拍干。

2. 用封闭液稀释酶标检测抗体至工作浓度（按说明书操作）。

3. 每孔加入100μL稀释后的酶标抗体，空白孔加100μL封闭液。

4. 封板后37℃孵育1小时，使酶标抗体与抗原的另一个表位结合，形成“捕获抗体-抗原-酶标抗体”三明治结构。

四、洗涤与显色

1. 洗涤：弃去孔内液体，PBST洗涤5次（比前几步多2次，彻底去除未结合的酶标抗体，降低背景），最后一次拍干。

2. 显色：每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物液（避光操作，底物需现配现用），封板后37℃避光孵育10-20分钟（根据显色情况调整，待标准品高浓度孔出现明显蓝色即可）。

五、终止反应与读数

1. 终止：每孔迅速加入50μL终止液（2NH₂SO₄），此时溶液颜色由蓝色变为黄色，反应立即终止。

2. 读数：10分钟内将酶标板放入酶标仪，选择450nm波长（若有参考波长，可设630nm扣除背景），测定每孔的吸光度值（OD值）。

六、结果分析

1. 数据处理：扣除空白孔OD值后，以标准品浓度为横坐标（X轴，对数坐标更佳），对应OD值为纵坐标（Y轴），用酶标仪自带软件或Excel制作标准曲线，计算回归方程（R²需≥0.98，保证线性关系良好）。

2. 定量计算：将待检样本的OD值代入回归方程，计算出样本中目标抗原的浓度，再乘以样本稀释倍数，得到最终实际浓度。

3. 结果判断：通常以“样本OD值＞2倍空白孔OD值”为阳性判定标准，结合定量结果分析样本中抗原的表达水平。