无荧光信号 / 信号极弱

1. 抗原未充分暴露（未做抗原修复或修复不当）；

2. 固定过度导致抗原表位破坏；

3. 荧光淬灭（试剂过期、未避光操作）；

4. 孵育时间 / 温度不足

5. 一抗 / 二抗失效、种属不匹配或稀释度过高；

1 按抗原类型选择修复方式（蛋白类用柠檬酸盐缓冲液热修复，核酸类用胰酶消化）；

2. 优化固定条件（4% 多聚甲醛固定 15~20min，避免高温久置）；

3. 全程避光操作，使用新鲜荧光底物；

4. 一抗 4℃孵育过夜，二抗室温孵育 1~2h

5. 验证抗体有效性，按说明书调整稀释比（一抗 1:100~1:500，二抗 1:200~1:1000），分装冻存；

非特异性高背景（整体发亮）

1. 抗体浓度过高；

2. 封闭不充分（封闭液选择不当或时间过短）；

3. 洗膜 / 洗涤不彻底；

4. 二抗交叉反应；

5. 样本自发荧光（如胶原、色素细胞）

1. 降低抗体浓度（如一抗 1:200 改为 1:500）；

2. 用 5% BSA 或血清封闭 1~2h（室温），匹配二抗种属；

3. 洗涤用含 0.1% Tween-20 的 PBS，每次 5~10min，共 3~4 次；

4. 选择特异性高的单克隆一抗，二抗严格匹配一抗种属；

5. 自发荧光样本可使用淬灭剂，或选择长波长荧光素

荧光信号不均一（斑点状 / 局部强信号）

1. 抗体孵育未充分摇匀，分布不均；

2. 抗体或封闭液有沉淀；

3. 样本贴片不平整，存在气泡；

4. 孵育时试剂体积不足，未完全覆盖样本

1. 孵育时置于摇床上缓慢摇匀（50~100rpm）；

2. 试剂使用前 10000rpm 离心 5min 去除沉淀；

3. 贴片时避免气泡，确保样本与载玻片紧密贴合；

4. 按每片样本≥100μL 准备试剂，确保完全覆盖

荧光淬灭快

1. 荧光染料稳定性差（如 FITC 易淬灭）；

2. 未使用抗淬灭封片剂；

3. 激发光照射时间过长

1. 选择稳定性高的荧光染料（如 Alexa Fluor 系列）；

3. 染色后用含抗淬灭剂的封片剂封片；

3. 观察时缩短激发光照射时间，避免长时间连续曝光

细胞形态破坏

1. 固定剂浓度过高或固定时间过长；

2. 抗原修复条件剧烈（如高温时间过长）；

3. 洗涤时缓冲液渗透压不适；

4. 操作过程中机械力损伤（如吹打过于剧烈）

1. 调整固定剂浓度（4% 多聚甲醛为宜），缩短固定时间（15~20min）；

2. 优化抗原修复参数（热修复温度 95~100℃，时间 10~15min）；

3. 使用等渗 PBS 作为洗涤缓冲液；

4. 操作时动作轻柔，避免剧烈吹打或刮擦样本

特异性荧光定位异常

1. 抗原表位被掩盖（如蛋白折叠导致）；

2. 一抗识别位点错误；

3. 固定不及时导致抗原移位；

4. 透化过度（如胞膜蛋白检测时使用过高浓度 Triton X-100）

1. 优化抗原修复方式，或使用去垢剂辅助暴露表位；

2. 确认一抗识别位点与目标蛋白定位匹配；

3. 样本采集后立即固定，避免抗原扩散；

4. 透化时使用 0.1%~0.2% Triton X-100，胞膜蛋白检测可省略透化步骤