特异性信号弱 / 无信号

1. 抗原修复不足（表位暴露不充分）；

2. 封闭过度或洗涤过强；

3. 荧光素 / 显色剂不兼容

4.  抗体失效（表位不匹配）；

1. 选择目标适配的修复方式（柠檬酸盐缓冲液 / EDTA，95~100℃修复 15~20min）；

2. 调整封闭时间（室温 1~2h）和洗涤次数（PBS-T 洗涤 3 次，每次 5min）；

3. 选用兼容标记物（如荧光法 mIHC 选发射光谱不重叠的荧光素）

4. 验证抗体特异性，优化稀释比例（1:50~1:200）；

非特异性背景高

1. 抗体浓度过高；

2. 封闭不充分（封闭液选择不当）；

3. 一抗 / 二抗间存在交叉反应；

4. 信号放大步骤未优化

1. 降低抗体浓度（如 1:100 调整为 1:200）；

2. 用种属匹配血清或 5% BSA 封闭；

3. 设置同型对照，选用单特异性一抗和交叉吸附二抗；

4. 调整放大步骤（如缩短酪酰胺信号放大（TSA）孵育时间）

信号重叠 / 串扰

1. 荧光素发射光谱重叠；

2. 抗体剥离不彻底（序贯染色时）；

3. 检测试剂交叉反应

1. 选用发射光谱不重叠的荧光素（如 Alexa Fluor 488/594/647）；

3. 优化剥离方案（如用 pH 2.2 的甘氨酸 - HCl 缓冲液处理 10~15min）；

3. 增设试剂特异性封闭步骤，验证检测系统兼容性

染色不均一

1. 抗体孵育不均（试剂聚集）；

2. 组织切片厚度不一致；

3. 抗原修复不均匀；

4. 抗体 / 试剂中存在沉淀

1. 摇床孵育（50~100rpm），确保试剂完全覆盖样本；

2. 标准化切片厚度（3~5μm）；

3. 修复时保证加热均匀；

4. 试剂使用前离心（10000rpm，5min）去除沉淀

信号淬灭

1. 荧光素稳定性差；

2. 未使用抗淬灭封片剂；

3. 光照时间过长；

4. 环境温度过高

1. 选用光稳定荧光素（如 Alexa Fluor、DyLight 系列）；

2. 用含 DAPI 的抗淬灭封片剂封片；

3. 减少激发光照射时间，使用快速捕获成像系统；

4. 染色和成像过程尽量在 4℃或冰上进行（如条件允许）

组织损伤

1. 抗原修复条件剧烈（过热 / 时间过长）；

2. 去垢剂浓度过高（如 Triton X-100）；

3. 洗涤 / 剥离过程中机械力损伤；

4. 固定剂不兼容

1. 优化修复条件（降低温度 / 缩短时间）；

2. 降低去垢剂浓度（0.1% Triton X-100）；

3. 轻柔洗涤，避免剧烈晃动；

4. 用 4% 多聚甲醛室温固定 15~20min，避免过度交联固定

实验间信号强度不一致

1. 抗体批次差异；

2. 试剂浓度不统一；

3. 孵育温度 / 时间未控制；

4. 组织处理流程不一致（固定 / 储存）

1. 使用同一批次抗体，分装后 - 80℃冻存；

2. 标准化试剂配制流程；

3. 用温控孵箱，严格控制孵育时间；

4. 标准化组织固定（采集后立即固定）和储存（石蜡切片 - 20℃保存）